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峰型拖尾-不得不说的秘密

化学分析实验室2020-03-15 07:22:44
目录


前言

引起峰拖尾的原因及改善方法

柱物理损坏

柱内填料污染

样品浓度过高致使柱超载

溶解样品的溶剂极性强于流动相引起拖尾

柱外效应

缓冲不足或不合适

⊙  固定相中硅醇基与胺类相互作用引起拖尾

⊙  酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾

⊙  柱内金属污染


前言

高效液相色谱在使用过程中,会出现很多问题,如:峰型拖尾、柱压升高、出现不明原因的倒峰、鬼峰、基线漂移、保留时间不重现等,我们会做一个系列专题,为大家一一解答。今天给大家整理的是峰型拖尾的原因及改善方法。

在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。特别是分离碱性化合物和通过HPLC分析药物成分时经常产生拖尾。峰拖尾可以引起分离度降低,灵敏度减弱,精密度和定量变差

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峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关。当峰拖尾(T,拖尾因子)从1.0增加到2.0时,分离度(Rs)从1.5降到1.0。灵敏度(峰高)由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。

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准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响。拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点,故而影响准确度和精密度。在这个例子中,在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。
引起峰拖尾的原因及改善方法:
一、柱物理损坏

色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源,使用时应避免色谱柱剧烈震荡或坠落,若出现色谱柱物理损坏,解决方法就是更换新柱。

二、柱内填料污染

流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。

流动相所用的各种溶剂尽量使用色谱纯试剂。流动相所用的水最好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。用前先用0.45μm溶剂微孔过滤器过滤,除去可能存在的微粒流动相建议现用现配,对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀。此外还得保证储存流动相的容器清洁。

复杂样品可选用0.45μm溶剂微孔过滤(器)或样品预处理柱对样品进行预处理,确保样品中不含微粒杂质。若样品不便处理,要使用保护柱。

柱内填料污染时,以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向,冲洗色谱柱(约20至30倍柱体积,或视具体情况而定;另外,此时不能接检测器),将污染物冲出色谱柱,再按色谱柱标明的使用方向使用。

三、样品浓度过高致使柱超载

当进样量超过柱子的容量,样品峰会呈现一个直角三角形。当更多的样品量注入时,峰的前端变得很尖而后端就拖尾更严重。另一个现象就是色谱柱过载后保留时间会随样品量的增加而提前。(见图3)由样品过载引起的峰拖尾的解决方案就是减少进样量。表1提供了各色谱柱的直径及参考的最大进样量,表1还提供了进样量的范围,因为实际进样量依赖于柱子的填料(具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量),分析物质(分子量大的进样量要少),和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。

图2
样品过载,峰的前端会变得尖锐,后端拖尾,保留时间会稍微提前。如果峰形看上去有点像直角三角形,那么可能就是过载了。

四、溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾

选择合适的样品溶剂,以排除不必要的干扰。最好选用流动相溶解样品。

五、柱外效应

柱外效应(即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积)是影响色谱柱柱效的主要因素之一。所以在可能的条件下,色谱柱的两端连接管路要尽可能短,连接管内径尽可能细小,切口务必平整光滑,尽可能的减小死体积,以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。

六、缓冲不足或不合适

在缓冲不好或离子强度过低的分离中,也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾。增加缓冲浓度能改善此情况,表2给出了几种常用的缓冲溶液及缓冲范围。

常用缓冲溶液及缓冲范围


七、固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾

在反相HPLC中出现拖尾的另一个常见的原因是由于带正电荷的溶液(胺类)与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换而引起的二次保留(图4),具有显著的硅醇活性的固定相的色谱柱大部分都会发生此现象,而且中性pH(6~8)条件下比在酸性pH(<3)更易发生。


图4
酸性和中性的化合物一般不受影响,一些碱性化合物更易受到此效应的影响。如果是因为硅醇的原因引起的拖尾,可以从下面几步来纠正拖尾的问题。

首先,确认流动相中有合适的缓冲盐,可能的话尽量在pH<3的条件下操作。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。在pH<3的条件下操作,可使硅胶固定相上的硅醇基质子化,减少了溶质与硅醇反应的几率。

另一种解决拖尾的方法是在流动相中加入竞争性的胺类,加到流动相中的三乙胺(TEA)就是这个目的。TEA可以与硅醇发生强的反应,并抑制样品中的胺类与硅醇反应。图5是TEA如何提高峰形的例子,多数情况下,大约10mM的TEA足够了。

有些色谱分析者反对向流动相中加入竞争性的胺类,因为增加了分析方法的复杂性并且用一种不易逆转的方法改变了色谱柱的性质。强度胺类,像三乙胺,不易从色谱柱上洗脱下来。那意味着用过含有TEA的色谱柱就不再适合应用于流动相中不含TEA的分析。


图5
八、酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾

虽然较胺类引起的拖尾少,酸类物质有时候引起峰的展宽和拖尾主要由于硅胶固定相的吸附。纠正因为此类原因引起的拖尾就应提高流动相中盐的浓度来抑制二次反应,降低流动相的pH使硅醇和溶质质子化,必要时可以向流动相中加入竞争性的酸(图6)

图6
九、柱内金属污染

柱内金属污染(Fe,Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金属可由填料本身带进,也可由腐蚀性流动相缓慢溶解柱进口的金属滤片,随流动相沉积到柱填料中。例如C18柱填料被金属污染后,造成酸性/碱性样品拖尾,可用碱洗/酸洗后再键合的填料,得到的峰是尖锐且对称的。


转自赛分科技

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